Avidin-peroxidáza
Avidin-peroxidáza (též avidin-peroxidasa) je modifikovaná peroxidáza (nejčastěji získávaná z křenu selského, Armoracia rusticana), na kterou je kovalentně připojen protein avidin (z vaječného bílku).
Použití
Avidin-peroxidáza se velmi často používá v laboratoři k vizualizaci různých biochemických interakcí (protein-proteinových, protein-sacharidových, …), u nichž jeden z účastníků této interakce je modifikován biotinem. Avidin je schopen se specificky a velmi silně vázat na biotin a přes tzv. avidin-biotinový můstek je tedy schopen připojit peroxidasu k interagujícím látkám.
Peroxidáza pak po dodání zdroje peroxidu (H2O2, NaBO3, …) a vhodného substrátu (jenž oxiduje a změní jeho vlastnosti –barva, rozpustnost) vizualizuje tuto interakci. Příkladem vhodných substrátů mohou být 4-chloro-1-naftol - po oxidaci dochází ke vzniku nerozpustné fialové látky – a ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát), který tvoří stabilní, zeleně zbarvené rozpustné radikály.
Avidin peroxidasy se často využívá při metodě ELISA a ELBA metodě a při western blotu. Podobně jako avidin-peroxidasa se však také často využívá kyselá nebo alkalická avidin-fosfatáza.
Stavební částice
Křenová peroxidáza
| křenová peroxidáza | |
|---|---|
| alternativní názvy | HRP, horseradish peroxidase |
| zdroj | křen selský (Armoracia rusticana) |
| molekulová hmotnost | ~44 000[1] |
| počet isoenzymů | 7[2] |
| pI | 3-9 |
| pH optimum | 6-6,5[3] |
| inhibitory | CN−, S2−, F−, N3−, Fe3+,[4] |
Avidin
| avidin | |
|---|---|
| zdroj | vaječný bílek |
| molekulová hmotnost | homotetramer, celková Mr = 66-69 000 |
| pI | 10,5 |
| biologická funkce | antimikrobiální agents, vyvazuje biotin nutný pro růst bakterii (KD(avidin-biotin) = 1,10-15M) |
Podobně jako avidin se používá i streptavidin - protein o podobných vlastnostech jako avidin (silná a specifická vazba biotinu) izolovaný z Streptomyces avidinii. Na rozdíl od avidinu není streptavidin vůbec glykosylován.
Používané substráty avidin peroxidázy
| zkratka | název | rozpustnost produktu |
| DAB | 3,3'diaminobezidin | N |
| 4-CN | 4-chloro-1-naftol | N |
| HYR | Hanker-Yaks reagent | N |
| AEC | 3-amino-9-ethylethanol | N |
| TMB | 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin | N |
| OPD | o-fenylendiamin | R |
| ABTS | 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonát | R |
Příprava avidin-peroxidázy
Křenová peroxidáza je kovalentně připojena na avidin pomocí bismaleimidu (dimaleimidu) v poměru přibližně 2:1 (HRP:avidin)[5]
Odkazy
Reference
- ↑ Welinder, K.G., Eur. J. Biochem., 96, 483–502 (1978)
- ↑ Shannon, L.M., et al., J. Biol. Chem., 241, 2166–2172 (1966).
- ↑ Schomberg, D., Salzmann, M., and Stephan, D., Enzyme Handbook 7, EC 1.11.1.7:1–6 (1993).
- ↑ Zollner, H., Handbo]ok of Enzyme Inhibitors, 2nd Ed., Part A: 367–368 (1993).
- ↑ O'Sullivan MJ, et al, FEBS letters, 35, 311-313 (1978).
Související články
- ELISA
- avidin
- peroxidázy
- mikrotitrační destička
Média použitá na této stránce
Autor: Matthew R G Russell, Licence: CC BY 3.0
Compartments of the endocytic pathway in HeLa cells. Early endosomes (E), late endosomes/MVBs (M), and lysosomes (L) are visible. Epidermal growth factor receptors (EGFR) and transferrin (Tf) are labelled in the early endosomes.
Epidermal growth factor receptors are labelled with an antibody conjugated to 10 nm gold, applied to the cell surface. The cells were stimulated with EGF and allowed to internalize the receptors, bringing the gold with them. The image was taken 5 minutes after internalization, at which point most of the EGFR-gold has reached early endosomes (black dots, marked by arrowheads), but has not yet entered late endosomes or lysosomes. The cells are also loaded with transferrin conjugated to horseradish peroxidase (TfHRP). The HRP catalyses a reaction in the presence of DAB that produces a dark stain in the transferrin containing compartments in the image.
HeLa cells were preincubated for 1 h in serum-free medium. For the final 30 minutes the cells were incubated with TfHRP. The cells were then incubated with EGF and anti-EGFR 10 nm gold-conjugated antibody for 30 minutes at 4°C, washed, and incubated at 37°C for a further 5 minutes, all in the presence of TfHRP. Arrowheads; anti-EGFR 10 nm gold. Dark content; cross linked TfHRP. Bar, 500 nm.
Philips EM400 TEM
Methods for cell fixation and preparation for electron microscopy can be found in the reference below. Briefly, cells were room temperature fixed, a DAB reaction was done, and the cells were osmium stained, dehydrated and embedded en face in epon.
Related reference;
Doyotte, A., Russell, M.R.G., Hopkins, C.R., Woodman, P.G. (2005) Depletion of TSG101 forms a mammalian ‘‘Class E’’ compartment: a multicisternal early endosome with multiple sorting defects. J. Cell Sci, 118:3003-3017.Chemical structure of biotin (vitamin H/B7)
Glutathione Peroxidase 1